摘要：通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化了肥皂莢皂苷的水浸提工藝，分析了皂苷的表面活性性能，并對皂苷結構進行了初步表征，結果表明:肥皂莢皂苷水浸提的最佳工藝條件為2.0 g肥皂莢果皮粉末，提取溫度69℃，提取時間11 h 15 min，液料比10∶1(mL∶g)，在此條件下，皂苷得率達26.49%。經(jīng)過大孔吸附樹脂純化后得到60%乙醇洗脫皂苷和90%乙醇洗脫皂苷，其最低表面張力分別為47.43和35.83 mN/m，臨界膠束濃度分別為0.35和0.75 g/L，皂苷中總糖分別為58.46%和51.16%。2種皂苷中單糖均為葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖等，但單糖含量略有差異。紫外和紅外光譜分析表明:2種肥皂莢皂苷樣品的紫外最大吸收波長均為470 nm左右，且均具有皂苷的基本紅外特征。

肥皂莢(Gymnocladus chinensis)，為豆科肥皂莢屬落葉喬木，廣泛分布于中國各地如江蘇、浙江、江西、安徽、福建、湖北、湖南等。肥皂莢果皮中含有豐富的皂苷，屬于天然環(huán)境友好型的表面活性劑，目前仍沒有得到充分開發(fā)利用。目前關于肥皂莢皂苷提取工藝的研究較少，僅有關于肥皂莢種皮中提取得到的皂苷結構的研究及其在藥物方面應用的探究，具體表現(xiàn)為其在抑制酶活性和抗增殖活性等方面有一定的作用。皂苷的提取工藝主要有有機溶劑提取、超臨界CO2提取和水浸提3種方式。有機溶劑提取不僅操作繁瑣，而且污染環(huán)境；超臨界CO2提取對設備要求較高，會增加提取成本；而水浸漬法提取皂苷具有操作簡單、安全可靠、成本低和綠色環(huán)保等優(yōu)點。因此，本研究以肥皂莢果皮為原料，采用水浸提的方法，在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化肥皂莢皂苷的提取工藝；并對純化后得到的皂苷進行性能分析和初步的結構表征，以期為肥皂莢資源的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1原料、試劑與儀器

肥皂莢果皮，采集于湖北省，干燥、粉粹、過篩，選取粒徑≤0.250 mm部分，存放于干燥器中備用；香草醛、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸、α-萘酚、溴化鉀、鹽酸、石油醚(沸程60~90℃)，均為分析純試劑(北京化工試劑廠)；AB-8型大孔吸附樹脂；葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，美國SIGMA公司；純凈水等。

UV-6100A紫外-可見分光光度計，上海比朗儀器有限公司；Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，Bruker公司；Waters 2695高效液相色譜(配備Aminex HPX-87P柱子和2414 RID示差折光檢測器)，Waters公司；Delta-8全自動高通量表面張力儀，芬蘭Kibron公司。

1.2肥皂莢皂苷的提取

1.2.1工藝流程

準確稱取2.0 g肥皂莢果皮粉末，按照一定液料比與蒸餾水混勻于具塞錐形瓶中，置于預設好的振動頻率110 r/min的搖床中，在一定的溫度下提取一定的時間，結束后將提取液放置于離心管中，4 000 r/min離心20 min，得到的上清液為粗皂苷水溶液。

1.2.2工藝優(yōu)化

分別選取不同提取溫度(25、35、45、55、65、75和85℃)、提取時間(8、12、16、20和24 h)、液料比(5:1、8:1、10:1、12:1、15:1和20:1，mL:g，下同)進行單因素試驗，計算皂苷得率，比較不同條件對肥皂莢皂苷得率的影響。

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計方案，以提取溫度(A)、提取時間(B)和液料比(C)為考察因素，皂苷得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化肥皂莢皂苷提取工藝。

1.2.3皂苷得率的測定

參考香草醛-濃硫酸法使用自制的肥皂莢皂苷標準品作標準曲線。準確稱量1.0 g自制肥皂莢皂苷標準品溶于水中，配置1 g/L的標準液。分別取標準液0.20、0.25、0.30、0.35和0.40 mL，置于10 mL具塞試管中，滴加去離子水至0.5 mL以配置成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 g/L的標準溶液，再滴加0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液，于冰水浴中滴加4 mL的質(zhì)量分數(shù)77%的濃硫酸，搖勻后置于60℃的恒溫水浴鍋中15 min，再移至冰水浴中放置10 min，在最大吸收波長470 nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(Y)，標準品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)制作標準曲線。得到線性回歸方程為：Y=0.947 2X+0.000 6，相關系數(shù)R2=0.999 3。

取1.2.1節(jié)中得到的粗皂苷水溶液0.5 mL，分別加入0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液和4 mL的質(zhì)量分數(shù)77%的濃硫酸，搖勻后于60℃的水浴鍋中反應15 min，再置于冰水浴中靜置10 min，再在470 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，并根據(jù)標準曲線計算皂苷的質(zhì)量濃度。根據(jù)下式計算皂苷得率(y)：

式中：C—粗皂苷水溶液中皂苷的質(zhì)量濃度，g/L；V—粗皂苷溶液的體積，L；m—原料質(zhì)量，g。

1.3肥皂莢皂苷的純化

粗皂苷水溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥得到粗皂苷粉末。配置30 g/L的粗皂苷水溶液，通過已經(jīng)處理好的大孔吸附樹脂上樣，吸附完成后，用水進行洗滌至無游離糖存在。前期研究表明AB-8大孔樹脂對皂苷類化合物有較好的吸附性能，因此本研究采用AB-8樹脂進行純化。最后使用30%、60%和90%乙醇進行梯度洗脫，得到60%和90%乙醇洗脫這2種皂苷樣品(30%的乙醇洗脫液中并未檢測到皂苷的存在)。

1.4皂苷的性能表征

1.4.1表面張力的測定

取適量的干燥后的60%和90%乙醇洗脫的2種皂苷樣品，配置成一系列濃度梯度的皂苷水溶液，在30℃下采用Delta-8全自動高通量表面張力儀測定各濃度樣品的表面張力。

1.4.2臨界膠束濃度的確定

根據(jù)1.4.1節(jié)得到的2種皂苷的表面張力，取濃度對數(shù)值為橫坐標，表面張力為縱坐標，由圖判斷表面張力不再有明顯下降所對應的最低濃度為臨界膠束濃度。

1.5皂苷的結構表征

1.5.1紫外和紅外光譜分析

將1.3節(jié)純化得到的2種皂苷樣品取適量配成水溶液，采用UV-6100A紫外-可見分光光度計，采用香草醛-濃硫酸法，在400~900 nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描。采用Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀，對絕干后的2種皂苷樣品采用KBr壓片法，在波數(shù)為400~4000 cm-1范圍內(nèi)進行掃描。

1.5.2高效液相色譜(HLPC)分析

將2種皂苷樣品分別放入具塞耐壓瓶中，加入適量1 mol/L稀鹽酸，于100℃水解1 h。冷卻至室溫后用NaOH中和至pH值為3~4，4 000 r/min離心10 min。取上清液用0.22μm濾膜過濾，HPLC測定。采用美國國家可再生能源實驗室標準方法測定皂苷樣品中單糖成分，HPLC配置示差折光檢測器(35℃)，在65℃條件下使用Aminex HPX-87H柱，流動相為0.5 mL/min的0.005 mol/L H2SO4。